Kloning Gen Penyandi Protein Struktural Virus Hepatitis C Isolat Jawa Tengah Indonesia

*Oleh: Afiono Agung Prasetyo, dr., Ph.D (PeerGroup Puslit Biotek Biodiv)

Tujuan jangka panjang penelitian ini adalah dimilikinya replikon dan sistem infeksius virus hepatitis C (HCV) isolat lokal (Indonesia). Replikon dan sistem infeksius tersebut akan digunakan untuk mempelajari strategi replikasi, diagnosis, vaksin maupun terapi HCV. Tujuan jangka pendek penelitian ini adalah dimilikinya kloning gen penyandi protein struktural virus hepatitis C yang akan digunakan untuk penelitian lanjutan di bidang diagnosis dan pembuatan vaksin. Untuk tujuan tersebut telah dilakukan isolasi RNA HCV dari spesimen plasma darah dengan anti-HCV positif. Isolat RNA ini dibuat bentuk cDNA-nya dan sebagian daerah NS5B dan E1-E2 diamplifikasi dengan RT-PCR dua langkah. Produk PCR kemudian disekuensing dan dianalisis filogenetiknya. Hasil analisis filogenetik ini digunakan untuk memilih isolat yang dikloning genomnya, dan terpilih isolat 09IDSKAC-20 yang memiliki genotipe 1a. Desain primer dan dilakukan dengan program FastPCR. Selanjutnya dilakukan isolasi RNA ulang dari aliquot plasma isolat yang dipilih untuk tujuan kloning. Kloning dilakukan dengan RT-PCR menggunakan Accuprime Pfx PCR Polymerase, kemudian produk PCR setelah dimurnikan disubkloningkan ke pETBlue-1 vector. Plasmid kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten. Koloni sel kompeten dipanen, kemudian plasmid diekstrak dan kemudian disekuensing. Genom HCV yang terdapat di dalam plasmid vektor disekuensing dengan menggunakan primer universal untuk pETBlue-1, yaitu pETBlueUP primer #70604-3 untuk forward primer dan pETBlueDOWN primer #70603-3 untuk  reverse primer. Hasil sekuensing tersebut dianalisis menggunakan program Sequence Viewer dan MEGA4.